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【摘要】目的 檢測(cè)特應(yīng)性皮炎(AD)患者外周血輔助性T細(xì)胞22(Th22)的表達(dá)，探討其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 以濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)(EASI)評(píng)分評(píng)估患者病情，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)46例AD患者和28例健康對(duì)照者外周血Th22(IL-22)細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)血清中IL-22、IFN-γ、IL-4水平。結(jié)果 AD患者外周血Th22細(xì)胞(2.35±0.64)%，明顯高于對(duì)照組的(0.94±0.43)%(P＜0.01)；Th22細(xì)胞與血清中IL-22呈正相關(guān)(r=0.48，P＜0.05)，而與IFN-γ、IL-4無相關(guān)(r=-0.105，P＞0.05；r=-0.267，P＞0.05)，Th22細(xì)胞與疾病的EASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.53，P＜0.05)。結(jié)論 Th22細(xì)胞有可能作為監(jiān)測(cè)AD嚴(yán)重程度或病情波動(dòng)的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】特應(yīng)性皮炎；外周血；輔助性T細(xì)胞22

特應(yīng)性皮炎亦稱異位性皮炎，是一種與遺傳有關(guān)的特發(fā)性炎癥性皮膚病，病因尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為Th22細(xì)胞在AD的發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)AD外周血Th22細(xì)胞的數(shù)量，分析其與IL-22、IFN-γ、IL-4及疾病EASI評(píng)分的相關(guān)性，進(jìn)而探討其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用與臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年2月至2012年1月我院門診AD患者46例，均符合1980年Hanifin和Rajka制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，停用抗組胺藥一周以上，半年內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。其中男26例，女20例；年齡2~48歲，平均(21.1±6.36)歲；3例伴有過敏性鼻炎病史，2例伴有哮喘病史。另選擇健康志愿者28例作為對(duì)照，其中男16例，女12例；年齡3~46歲，平均(23.56±4.36)歲。所有檢查均征得患者和志愿者的知情同意，并填寫知情同意書。

1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀器為Beckman Coulter EP-ICS XL產(chǎn)品；單克隆熒光直標(biāo)抗體鼠抗人IL-22A-FITC，CD4-Pecy5為美國(guó)Biolegend公司產(chǎn)品及相應(yīng)的同型對(duì)照FITC標(biāo)記鼠IgG1、Pecy5標(biāo)記鼠IgG1；固定劑及破膜劑(FIX&PERM Caltag公司)；RPMI1640、PMA、Ionomycin和Monensin(Sigma公司)；美國(guó)產(chǎn)BB5060型CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱；ELISA試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Th22的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)，無菌抽取靜脈血3ml，枸櫞酸鈉充分抗凝。按一定的比例進(jìn)行全血細(xì)胞刺激培養(yǎng)4h(全血細(xì)胞刺激培養(yǎng)：每管加入0.5ml無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、0.5ml枸櫞酸鈉抗凝的全血和終濃度為25ng/ml的PMA、1μg/ml的Ionomycin、20ng/ml的Monensin，混勻后置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h)。培養(yǎng)后的全血細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，分成2管，分別加10 μl抗CD4+抗體進(jìn)行表面染色，混勻后室溫暗處放置30 min；加固定劑50μl，室溫放置15 min加入4ml PBS洗滌，1500r/min，離心10min，去上清液；加通透劑30μl，2管分別加入抗IL-22抗體及FITC抗體同種型對(duì)照，混勻后室溫暗處放置15 min，用相配套溶血素溶血，洗滌1次，去上清液，加PBS 500μl配成1.0×10⁷/L的細(xì)胞懸液，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 血清IL-22、IFN-γ、IL-4的檢測(cè) 采用ELISA法，用促凝管采空腹靜脈血2ml，3000rpm，10min分離上清液，取足夠上清液于離心管中，70℃保存，備用，避免反復(fù)凍融，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x(-)±s)表示，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 AD患者外周血Th22細(xì)胞為(2.35±0.64)%，明顯高于對(duì)照組的(0.94±0.43)%，差異有極顯著性(P＜0.01)。

2.2 對(duì)46例AD患者血清中細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：IL-22的濃度為(8.76±9.36)pg/ml；IFN-γ的濃度為(33.69±10.28)pg/ml；IL-4的濃度為(18.76±11.53)pg/ml。分別將其與Th22細(xì)胞作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：IL-22與Th22細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.48，P＜0.05)，IFN-γ、IL-4與Th22細(xì)胞均無相關(guān)(r=-0.105，P＞0.05；r=-0.267，P＞0.05)。

2.3 按照濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)(EASI)評(píng)分法對(duì)AD患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，46例AD患者評(píng)分為(23.86±18.35)(范圍：0~62.6)，Th22細(xì)胞與EASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.53，P＜0.05)。

3 討論

特應(yīng)性皮炎是皮膚科常見病、多發(fā)病，正成為公共健康的主要問題之一。目前，研究特應(yīng)性皮炎與Th細(xì)胞亞群的文獻(xiàn)很多，但結(jié)論各不相同，隨著對(duì)特應(yīng)性皮炎及Th細(xì)胞亞群研究的逐漸深入，Th細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子在特應(yīng)性皮炎中的作用得到更廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為AD的發(fā)病與Th1/Th2的失衡有關(guān)。

最近幾年，有報(bào)道稱，在異位皮炎病人的病灶組織中存在一群產(chǎn)生IL-22但不產(chǎn)生IL-17、IFN-γ和IL-4的細(xì)胞。這種新型的T細(xì)胞亞群，被定義為Th22細(xì)胞，其既不同于傳統(tǒng)Thl和Th2細(xì)胞，也不同于近年發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞，參與皮膚的自穩(wěn)調(diào)節(jié)和病理狀態(tài)，由此對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制提出了新的挑戰(zhàn)。本研究通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血Th22較對(duì)照組明顯升高，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)Th22細(xì)胞在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。

Th22細(xì)胞的表型為CCR6+CCR4+CCR10+，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是芳香烴受體(AHR)，主要分泌IL-22，還可分泌IL-l0、IL-13、IL-26、腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子。其功能主要是通過IL-22來實(shí)現(xiàn)的。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-23或IL-6均可誘導(dǎo)刺激IL-22的表達(dá)。在漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞刺激下，IL-6和TNF-α可以促進(jìn)CD4+T初始細(xì)胞向Th22型細(xì)胞的分化。

IL-22最早由Dumoutier等命名為IL-10相關(guān)的T細(xì)胞衍生可誘導(dǎo)因子，由IL-9誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞瘤產(chǎn)生，其22%的氨基酸序列與IL-10同源。在人類體細(xì)胞中檢測(cè)出該因子，因而命名為IL-22。IL-22與其受體結(jié)合導(dǎo)致Janus激酶(JAK)和Stat活化，尤其是Stat3傳導(dǎo)途徑的活化。

有研究證實(shí)Th22與特應(yīng)性皮炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其分泌的IL-22表達(dá)升高，且IL-22CD8+T細(xì)胞數(shù)與異位皮炎的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，AD患者外周血Th22較對(duì)照組明顯升高，與IL-22呈正相關(guān)，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。我們推測(cè)，在AD的發(fā)病過程中，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13依次刺激嗜酸粒細(xì)胞增加，使其釋放出的IL-6促進(jìn)CD4+T初始細(xì)胞向Th22型細(xì)胞分化，而Th22型細(xì)胞主要分泌IL-22，因此IL-22的表達(dá)增強(qiáng)。IL-22與受體結(jié)合后能激活傳導(dǎo)通路中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，通過與靶基因DAN結(jié)合區(qū)域相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，參與AD的發(fā)病。本研究結(jié)果表明，AD患者外周血Th22細(xì)胞與IFN-γ、IL-4無相關(guān)，提示屬于Th1細(xì)胞因子的IFN-γ和Th2細(xì)胞因子的IL-4與Th22細(xì)胞的分化無關(guān)，是獨(dú)立于Th1和Th2的細(xì)胞亞群。

Th22細(xì)胞作為一個(gè)獨(dú)立的新型輔助性T細(xì)胞具有特殊的表型和生物學(xué)效應(yīng)。隨著研究的深入，針對(duì)細(xì)胞因子的靶向治療成為可能，為特應(yīng)性皮炎的治療提供理論依據(jù)。至于Th22究竟以什么方式參與特應(yīng)性皮炎，其所分泌的細(xì)胞因子在整個(gè)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中處于什么環(huán)節(jié)，尚需要進(jìn)一步的研究。

(郭曉蘭，李秀娟，特應(yīng)性皮炎患者外周血輔助性T細(xì)胞22的表達(dá)及意義[J]國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)2012年第18卷第l4期：2025-2026)

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