血管性癡呆（VD）是由各種原因引起的慢性腦灌注不足所致的認(rèn)知功能障礙, 海馬CA1區(qū)是缺血缺氧最敏感的部位，N�布谆��睤�蔡�(門)冬氨酸受體（NMDAR）��1（NR1）是NMDAR的功能亞基，代表NMDA分布。鹽酸多奈哌齊片是近年來(lái)用于治療VD的膽堿酯酶抑制劑。本研究通過(guò)建立擬VD模型，采用對(duì)照研究的方法觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、NR1表達(dá)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH�睵X）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活力，探討鹽酸多奈哌齊片神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

    1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠48只（購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），質(zhì)量（400±50）g,隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD對(duì)照組和多奈哌齊組，每組16只。
　　1.1.2 主要儀器及試劑 MG��2 Y�残兔詫m（張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠）；NR1免疫組化試劑盒（博士德生物工程有限公司）；GSH�睵X、CAT試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鹽酸多奈哌齊片（法國(guó)PFIZER PGM公司制造，衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司分裝）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 模型制備及藥物干預(yù) 將大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)消毒,頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）。VD對(duì)照組和多奈哌齊組腹腔注射硝普鈉(2.5 mg/kg,用無(wú)菌蒸餾水溶解)，隨即將CCA夾閉、再通、再夾閉各10 min后再通，縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組不阻斷CCA，不注射硝普鈉，余操作過(guò)程相同。造模過(guò)程中保持動(dòng)物肛溫在37℃左右，以防止低溫對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。多奈哌齊組于大鼠完全清醒4 h后，給予多奈哌齊1 mg/kg（溶解于生理鹽水中）灌胃，每日1次共30 d；假手術(shù)組和VD對(duì)照組給予生理鹽水1 ml共30 d。
　　1.2.2 Y�残兔詫m試驗(yàn) 術(shù)后第25 d行迷宮測(cè)試，先將大鼠放入迷宮中適應(yīng)3～5 min，然后以無(wú)規(guī)則次序變換安全區(qū)，以訓(xùn)練大鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。大鼠受電擊逃到安全區(qū)后以大鼠所在支臂作為下一次測(cè)試的起始位置，每個(gè)實(shí)驗(yàn)日在固定時(shí)間（下午5～8點(diǎn)）對(duì)每只大鼠進(jìn)行20次訓(xùn)練,連續(xù)5 d。以大鼠在足底通電后10 s內(nèi)一次性跑向安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤反應(yīng)；全天完成所有反應(yīng)所需時(shí)間稱為全天總反應(yīng)時(shí)間 (TRT)。每日出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)(EN)≤2次、TRT≤120 s作為判定大鼠學(xué)習(xí)記憶的標(biāo)準(zhǔn)。
　　1.2.3 NR1表達(dá)水平檢測(cè) 術(shù)后第30 d行為學(xué)測(cè)試完畢后每組隨機(jī)選取8只大鼠麻醉后經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定取腦，在鼠腦最寬部位（海馬冠狀位）取厚度為3 mm的腦片，置4%多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚約5 μm，每只大鼠取5張切片，分別進(jìn)行HE染色及SP免疫組化染色檢測(cè)NR1表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用Qwin 550 CW圖像處理與分析系統(tǒng)，每張切片同一區(qū)域中，隨機(jī)選取8個(gè)視野，檢測(cè)面積大致相同，采集8組數(shù)據(jù)，取均值作為該切片NR1的平均灰度值。
　　1.2.4 GSH�睵X、CAT活力測(cè)定 各組另外8只大鼠麻醉后斷頭，冰盤上取腦，小心剝離海馬，按標(biāo)本質(zhì)量用生理鹽水配成10%的腦勻漿，低溫、3500 r/min、離心10 min，取上清液，按GSH�睵X、CAT試劑盒說(shuō)明操作測(cè)出光密度（OD）值，用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)標(biāo)本蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算出酶活力。OD值越高，酶的活力越低。
　　1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩樣本均數(shù)間采用t檢驗(yàn)，組間均數(shù)的顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析，滿足正態(tài)分布及方差齊性要求時(shí)采用LSD法，不滿足方差齊性要求時(shí), 則采用Dunnett�餋法。

    2 結(jié)果
　　2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)的比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，假手術(shù)組和多奈哌齊組，EN明顯減少，TRT明顯縮短(均P<0.01），假手術(shù)組和多奈哌齊組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2 各組腦組織形態(tài)學(xué)改變的比較 見(jiàn)圖1～3。HE染色可見(jiàn)假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密、均勻而整齊，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色質(zhì)均勻；對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散、數(shù)目減少、排列紊亂，胞核深染、固縮，核仁消失，胞漿周圍發(fā)現(xiàn)空暈，胞間距較大，并可見(jiàn)大量不規(guī)則形膠質(zhì)細(xì)胞及散在膠質(zhì)細(xì)胞增生小結(jié)，僅見(jiàn)少量正常神經(jīng)細(xì)胞；多奈哌齊組正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多，排列較密，胞核圓或橢圓形，核仁清晰，染色質(zhì)豐富，少見(jiàn)固縮變性的神經(jīng)元。
　　2.3 各組NR1分布及免疫灰度值的比較 見(jiàn)圖4～6及表2。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)層次清、排列緊密，可見(jiàn)NR1陽(yáng)性神經(jīng)元胞膜呈黃色，胞漿較淡，胞體大圓或橢圓形；對(duì)照組層次減少，排列稀疏，殘余的NR1陽(yáng)性神經(jīng)元胞膜呈深棕黃色，并可見(jiàn)胞核著色；多奈哌齊組神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，層次清，排列較密，NR1陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少且染色淡黃。NR1陽(yáng)性神經(jīng)元免疫反應(yīng)灰度值假手術(shù)組與多奈哌齊組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且顯著低于對(duì)照組（均P<0.01）。
　　2.4 各組GSH�睵X、CAT活力的比較 見(jiàn)表2。對(duì)照組GSH�睵X、CAT的活力低于多奈哌齊組及假手術(shù)組（P<0.0５～0.01）；多奈哌齊與假手術(shù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　
    3 討論
　　VD的確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。以谷氨酸受體為代表的興奮性氨基酸受體,特別是NMDAR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與短時(shí)學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān),并可以產(chǎn)生興奮毒性作用導(dǎo)致神經(jīng)元丟失。腦缺血后NMDAR活化是導(dǎo)致腦缺血后學(xué)習(xí)和記憶障礙的一種重要因素。有研究表明，缺血后NMDAR表達(dá)增加，并導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載觸發(fā)系列生化改變，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)可能是導(dǎo)致海馬細(xì)胞死亡的重要原因。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散、數(shù)目及層次減少、排列稀疏，殘余的NR1陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)顯著增高，表現(xiàn)為胞膜著色明顯加重，呈深棕黃色，并可見(jiàn)胞核著色，GSH�睵X、CAT的活力卻低于假手術(shù)組和多奈哌齊組；多奈哌齊組的神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，層次清、排列較密，NR1陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少且染色淡黃，只見(jiàn)到部分神經(jīng)元著色， CAT、GSH�睵X活力較對(duì)照組有較明顯地提高。表明鹽酸多奈哌齊片對(duì)缺血缺氧的神經(jīng)元有較顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能為：（1）拮抗NMDAR，主要是下調(diào)NR1的表達(dá)，來(lái)阻斷由其引發(fā)的鈣超載，進(jìn)而阻斷一系列導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)；（2）提高抗氧化酶�睪SH�睵X和CAT的活性，對(duì)抗過(guò)氧化氫導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。
　　Akasofu 等的研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸多奈哌齊片對(duì)處于缺血缺氧環(huán)境下的原代培養(yǎng)神經(jīng)元預(yù)處理12 h后，可減少乳酸脫氫酶（LDH）引發(fā)的NMDA釋放和海人酸的釋放，進(jìn)而降低鈣的濃度，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載,從而減輕了由NMDA誘發(fā)的神經(jīng)元損傷。有研究發(fā)現(xiàn)鹽酸多奈哌齊片可改善缺血腦組織的代謝、對(duì)抗細(xì)胞凋亡而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。
總之，NR1的表達(dá)增高和GSH�睵X、CAT活力的降低與VD發(fā)病有關(guān)，鹽酸多奈哌齊片不僅可以通過(guò)促進(jìn)腦部乙酰膽堿的功能來(lái)改善認(rèn)知障礙，而且也可能通過(guò)降低NR1的表達(dá)，提高GSH�睵X、CAT的活性等多途徑的分子生物學(xué)機(jī)制來(lái)減輕神經(jīng)元損傷。

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