神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是起源于胚胎期神經(jīng)嵴細胞的兒童惡性腫瘤，自然退化常見于新生兒、嬰兒和早期腫瘤，而較大兒童晚期患者惡性程度高，預(yù)后差。對化療耐藥是治療失敗的主要原因。如何應(yīng)用人為方法使NB細胞分化、逆轉(zhuǎn)、消退，是當(dāng)今腫瘤界研究的熱點問題，用藥物誘導(dǎo)NB向良性轉(zhuǎn)化可能成為臨床治療的一個新途徑。

　　1 資料與方法

　　1.1 一般資料

　　5歲男性患兒，因發(fā)現(xiàn)“腹部腫物”1周，于2004年6月10日入住本院，行腹部B超、CT檢查，考慮為神經(jīng)源性腫瘤；于2004年6月12日行剖腹探查、腹部腫物切除術(shù)。手術(shù)標(biāo)本冰凍切片提示神經(jīng)母細胞瘤。為Evans分期Ⅲ期，無遠處轉(zhuǎn)移，術(shù)后病理診斷：神經(jīng)母細胞瘤。

　　1.2 研究方法

　　(1)試劑：NGF；MTT。其它均為國產(chǎn)分析純試劑。Trizol購自美國GBICO公司；RT-PCR試劑盒購自Promega公司；TaqDNA合成酶、瓊脂粉購自上海生工生物工程公司；DNAMarker購自寶生物工程大連公司；引物TrkA引物序列根據(jù)Genebank資料設(shè)計如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGGAA，擴增產(chǎn)物為528bp，TrkA引物及β-actin(114bp)內(nèi)參照引物由北京賽百盛公司合成。(2)NB細胞培養(yǎng)：用消化法進行原代細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素0.1mg/ml，在5%CO2、95%空氣環(huán)境中恒溫恒濕孵育。(3)實驗分組：用作生長及分化研究的NB細胞分成4組。A組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為5μmol/L；B組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為10μmol/L；C組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為20μmol/L；D組：作為對照組，培養(yǎng)基中不加NGF干預(yù)。每組設(shè)4份同樣的標(biāo)本。(4)活細胞計數(shù)：取指數(shù)生長期細胞，接種至24孔培養(yǎng)板,細胞濃度為1×105細胞/ml，于0、2、4、6、8d用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞。(5)細胞形態(tài)學(xué)觀察：用作分化研究的細胞，以1×103/ml密度接種至25ml培養(yǎng)瓶中，A、B、C、D組同時接種，于0、2、4、6、8d在相差顯微鏡下計數(shù)分化細胞。方法：對每瓶細胞選取5個不同視野的200個細胞，根據(jù)Sandquist法，有一個或一個以上的軸突長度延伸至胞體直徑二倍以上者為細胞分化，計算細胞分化百分率。(6)MTT法檢測NB細胞增殖活性原理：活細胞，特別是增殖的細胞中，其中線粒體能量代謝中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍紫色的結(jié)晶沉積在細胞內(nèi)和細胞周圍，形成的結(jié)晶與細胞數(shù)成正比，用酸化異丙醇溶解結(jié)晶即可在酶標(biāo)比色計上直接比色，此數(shù)值的升高標(biāo)志細胞能量代謝旺盛、增殖活躍。檢測方法：細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞貼壁，按A、B、C、D組要求加入NGF，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一次；每孔加濃度5mg/ml的MTT染液20μl(溶于PBS中，濾過除菌，4℃避光保存)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育細胞4～6 h；加入新鮮配制的DMSO溶解MTT 150μl/孔，水平搖床上搖10min，使還原產(chǎn)物充分溶解，酶標(biāo)儀上570 nm波長下測定光密度值。(7)TrkA表達檢測：①NB細胞總RNA的提取：將培養(yǎng)的細胞用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測吸光度OD260值和OD280值，計算提取物濃度及純度。經(jīng)定量后用DEPC水稀釋至1mg/ml，-20℃保存。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。③PCR擴增反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為25μl，PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，變性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)。④擴增產(chǎn)物半定量分析：取10μl擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠(0.5μg/ml)的2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀觀察RT-PCR擴增產(chǎn)物，與Marker比較鑒定結(jié)果，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描擴增帶，用TrkA/β-actin比值表示TrkA的相對表達水平。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

　　用SPSS軟件進行方差分析，兩均數(shù)比較采用校正t檢驗。

    2 結(jié)果

　　2.1 NGF對NB細胞活細胞計數(shù)的影響。

　　2.2 NGF誘導(dǎo)NB細胞分化觀察

　　NB細胞呈小梭形，部分呈淚滴狀，少數(shù)呈三角形。經(jīng)NGF干預(yù)后，2d后開始出現(xiàn)形態(tài)分化，細胞變短、變圓，逐漸有神經(jīng)突起形成，類似樹突、軸突，整個細胞形態(tài)由原來的小梭形變?yōu)轭惗噙呅�，類似成熟的神�?jīng)節(jié)細胞。不同作用時間、不同濃度NGF干預(yù)的細胞分化百分率。

　　2.3 NGF對NB細胞增殖的抑制見表3。MTT檢測結(jié)果顯示NGF劑量依賴性的抑制NB細胞的增殖。

　　2.4 不同濃度NGF對TrkAmRNA/β�瞐ctin比值的影響見表4。NGF不同濃度誘導(dǎo)后，隨著作用時間和濃度的增長，TrkAmRNA表達均增強，與作用時間和NGF濃度正相關(guān)。

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