研究重組人腫瘤壞死因子(rHTNF)與γ-干擾素(IFN-γ)協(xié)同抗膀胱腫瘤的作用機(jī)理，探索治療膀胱腫瘤的新方法。

　　材料與方法　人膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU-87由北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所提供。(1)用MTT法[1]測定rHTNF或IFN-γ，以及在單獨(dú)應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，在不同藥物濃度及不同作用時(shí)間內(nèi)對BIU-87細(xì)胞的最大殺傷率。酶標(biāo)儀測定吸光度A值。殺傷率(%)=(對照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/對照孔A值×100%。(2)對經(jīng)過IFN-γ(0.15μg/ml)作用6小時(shí)與未經(jīng)IFN-γ作用的對照組BIU-87細(xì)胞，分別行放射配體結(jié)合時(shí)間、解離和特異性競爭試驗(yàn)，通過Scatchard圖計(jì)算受體數(shù)目及親和力，進(jìn)行rHTNF受體分析，觀察IFN-γ對TNF受體的影響。(3)IFN-γ對rHTNF內(nèi)化率和降解率的影響：經(jīng)IFN-γ作用6小時(shí)和未經(jīng)IFN-γ作用的BIU-87細(xì)胞分別與125I-rHTNF于37℃反應(yīng)3小時(shí)后，離心沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于0.1mmol/L、pH 3.0的甘酸-鹽酸緩沖液中，洗掉結(jié)合在細(xì)胞膜上的125I-TNF，測定細(xì)胞內(nèi)剩余的放射性，作為內(nèi)化量。50%的三氯醋酸可溶解125I-rHTNF降解產(chǎn)物，同時(shí)沉淀未降解的125I-rHTNF，溶液中的放射性即代表125I-rHTNF的降解量。然后計(jì)算細(xì)胞內(nèi)125I-rHTNF與細(xì)胞最大結(jié)合125I-rHTNF的比值作為內(nèi)化率;50%三氯醋酸溶液中的放射性與內(nèi)化放射性的比值即為降解率。

　　結(jié)　果　(1)rHTNF和IFN-γ單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對BIU-87細(xì)胞的最大殺傷率分別為61%和15%，兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對BIU-87細(xì)胞的最大殺傷率達(dá)89%，明顯高于rHTNF單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對BIU-87細(xì)胞的最大殺傷率(P<0.05)。(2)125 I-rHTNF與BIU-87細(xì)胞于37℃反應(yīng)3小時(shí)可達(dá)平衡狀態(tài)。解離曲線表明該反應(yīng)呈可逆性。非標(biāo)記的rHTNF可競爭性抑制125 I-rHTNF與BIU-87細(xì)胞的結(jié)合。IFN-γ對該結(jié)合試驗(yàn)無抑制作用。IFN-γ使BIU-87細(xì)胞表面受體數(shù)量由0.41×10-11nmol/細(xì)胞增加至0.92×10-11nmol/細(xì)胞，對受體的親和力無顯著影響。(3)IFN-γ可顯著提高BIU-87細(xì)胞對125I-rHTNF的內(nèi)化和降解的絕對量，但對內(nèi)化率和降解率無顯著影響。

　　討　論　TNF由激活的單核巨噬細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞分泌，具有多種生物活性，是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，其可能成為有一定臨床應(yīng)用價(jià)值的抗癌生物制劑。不同類型腫瘤細(xì)胞顯示對TNF不同的反應(yīng)：細(xì)胞毒性、生長抑制及無作用;甚至同一種類型細(xì)胞的不同細(xì)胞株對TNF作用亦表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。一般認(rèn)為耐受TNF的腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生小劑量的內(nèi)源性TNF，內(nèi)源性TNF通過誘導(dǎo)保護(hù)性蛋白的產(chǎn)生，減弱TNF對腫瘤細(xì)胞的毒性[2]。本研究結(jié)果表明，rHTNF對膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU-87的最大殺傷率為61%。IFN-γ和TNF對許多腫瘤細(xì)胞的生長抑制有協(xié)同作用，作用機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFN-γ和rHTNF對BIU-87細(xì)胞的殺傷亦有協(xié)同作用，其最大殺傷率可達(dá)89%。其協(xié)同作用可能部分與INF-γ增加BIU-87細(xì)胞表面的rHTNF受體表達(dá)有關(guān)。

　　TNF嚴(yán)重的毒副作用限制了臨床應(yīng)用。目前已經(jīng)有幾種TNF衍生物研制成功。本研究提示：TNF局部用藥是合理的，同時(shí)選擇毒副作用較輕的TNF衍生物與IFN-γ等與其協(xié)同抗腫瘤作用的細(xì)胞因子應(yīng)用，可在一定程度上減輕TNF的毒副反應(yīng)。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1]　Sargent J,Eigie R,Taylor CG,et al. The identification of drug resistance in ovarian cancer and breast cancer:application of the MTT assay. Contrib Gynecol Obstet,1994,19∶64-67.

　　[2]　Mutch DG,Powell CB, Lee CY，et al.Resistance to cytolysis by TNF in malignant gynecological lines is associated with the expression of protein that prevent the activation of phospholipase A2 by TNF.Cancer Res,1992,52∶866-72.