腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中所起的作用越來越受到關(guān)注。在膠質(zhì)瘤組織中，除了腫瘤細(xì)胞，還包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子等，統(tǒng)稱為腫瘤微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系十分復(fù)雜，在雙色熒光蛋白示蹤的可移植性腫瘤模型中，因腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞顏色不同而易于辨別兩組的相互作用關(guān)系。我們利用此模型進行的前期研究表明，膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞在腫瘤組織重構(gòu)中可融合宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)分化生成腫瘤血管。在本研究中，我們?nèi)匀焕�用此模型，觀察了膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞可誘導(dǎo)宿主膠質(zhì)細(xì)胞癌變。

　　材料與方法
　　一、材料
　　1．細(xì)胞株和實驗動物：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞SU3和NC-CB57/6J-GFP裸小鼠均又課題組自建。

　　2. 主要試劑：紅色熒光蛋白（red fluorescence protein，RFP）轉(zhuǎn)基因試劑盒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，小鼠抗2′、3′-環(huán)腺苷酸-3′-磷酸二酯酶（CNP）單克隆抗體和免抗Nestin多克隆抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品，小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體為美國BD公司產(chǎn)品，Alexa Fluor 555（紅色熒光）標(biāo)記閃耀抗小鼠IgG（H＋L）和Alexa Fluor 555（紅色熒光）山羊抗兔IgG（H＋L）購于上海碧云天公司。DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Cibco公司，胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品。

　　3. 主要儀器：多模式活體成像儀為KODAK公司產(chǎn)品，告訴分選流式細(xì)胞儀及普通流式細(xì)胞儀為Beckman公司產(chǎn)品，熒光倒置顯微鏡Carl Zeiss公司產(chǎn)品，小鼠立體定位儀、二氧化碳培養(yǎng)箱及酶標(biāo)儀均為國產(chǎn)。

　　二、實驗方法
　　1. 建立腫瘤模型：按傳染試劑盒操作手冊，經(jīng)慢病毒載體將RFP基因穩(wěn)定傳染于SU3細(xì)胞。經(jīng)過篩選得到高表達RFP的SU3細(xì)胞（SU3-RFP細(xì)胞 ）。收集SU3-RFP細(xì)胞25µl（1×106個），以立體定向技術(shù)，經(jīng)顯微磨鉆磨除的盧骨微骨孔直接穿刺，注入6周齡綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）裸小鼠的右尾狀核。按SPF級管理要求飼養(yǎng)于小鼠獨立送風(fēng)籠內(nèi)。接種后1個月左右，荷瘤鼠出現(xiàn)肢體活動障礙、抽搐和消瘦等臨床癥狀時，以Kodak熒光儀行荷瘤鼠活體腦攝影。然后處死裸鼠，行全腦解剖，取腫瘤組織做冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

　　2. 被SU3誘變細(xì)胞的克隆：取腫瘤組織，剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，于含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。以高速分選流式細(xì)胞儀分選，收集發(fā)綠色熒光的細(xì)胞103~104個，接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞集落的形成情況。為進一步純化細(xì)胞來源，以顯微虹吸法吸取單個細(xì)胞，接種于96個孔培養(yǎng)板內(nèi)，從其中10個培養(yǎng)孔中克隆得到具極強無限增值能力的細(xì)胞，命名為SU3誘導(dǎo)的宿主腦癌變細(xì)胞（SU3-induced host brain tumor cells，SU3-ihBTC）。挑選其中具無限增值能力、穩(wěn)定表達Nestin和CNP蛋白的2個亞株，分別命名為SU3-ihBTC-H9（H9），液氮凍存?zhèn)溆谩?

　　3. H1和H9細(xì)胞的體外生長特征檢測：棟存細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)于96孔板，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。將生長于蓋玻片上的細(xì)胞按試劑說明書進行Nestin、GFAP和CNP免疫組化染色。
　　細(xì)胞生長曲線測定：調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/ml，按每孔100µl加入96孔板中，設(shè)6個復(fù)孔，15個時相點，每24小時測定1個時相點的吸光度（A），根據(jù)各時間點的A值繪制生長曲線。
　　細(xì)胞集落形成率測定：取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔100個細(xì)胞接種于6孔板，每種細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后，計數(shù)每種細(xì)胞的貼壁細(xì)胞數(shù)，繼續(xù)培養(yǎng)6~8d。磷酸鹽緩沖液洗2遍，甲醇固定10min，棄去固定液，結(jié)晶紫染色20min ，自來水緩慢沖去染液，干燥，光鏡下計數(shù)細(xì)胞集落數(shù)（≧50個細(xì)胞為1個集落）。
　　Transwell侵襲實驗：將H1、H9和SU-3細(xì)胞以無血清DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個/ml，按150µl/孔接種于24孔板（美國Costar公司）上室中。上室預(yù)涂8µm厚的Matrigel（美國BD Bioscience公司）。下室加入含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基650µl，培養(yǎng)48h（此時細(xì)胞尚未突破小室底部的生物膜），用棉簽擦去生物膠上層尚未侵入生物膜的細(xì)胞，參照文獻的方法計數(shù)3株細(xì)胞侵入小室底部生物膜中的細(xì)胞數(shù)，評估3株細(xì)胞的侵襲能力。每株細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，分別計數(shù)10個視野下的細(xì)胞數(shù)。

　　4. H1和H9細(xì)胞分子分子遺傳學(xué)檢測：取培養(yǎng)瓶內(nèi)處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上測定細(xì)胞DNA量。對被檢細(xì)胞進行染色體顯帶分析和性別鑒定，同時以免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測GFAP、CNP和Nestin等細(xì)胞特異性分子標(biāo)志蛋白的表達。

　　5. H1和H9細(xì)胞的致瘤實驗：收集體外培養(yǎng)的H1細(xì)胞1×106個（150µl），接種于10只裸小鼠右腋下。收集體外培養(yǎng)的H9細(xì)胞1×106個（25µl），接種于5只裸小鼠盧內(nèi)。觀察兩組小鼠的致瘤率，并在接種腫瘤細(xì)胞40d后處死裸小鼠，對腫瘤組織行病理學(xué)檢測。

　　三、統(tǒng)計學(xué)方法
　　采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05.

　　結(jié)果
　　移植瘤模型特征：SU3-RFP細(xì)胞穩(wěn)定高表達RFP。SU3-RFP細(xì)胞接種于表達GFP的裸小鼠腦內(nèi)1個月左右，荷瘤鼠出現(xiàn)后肢功能障礙、消瘦、陣發(fā)性四肢抽搐等較為典型的中樞神經(jīng)受損癥狀。Kodak多功能活體成像顯示，發(fā)紅色熒光的腫瘤位于發(fā)綠色熒光的小鼠盧內(nèi)。激光共聚焦顯微鏡下可見，宿主成分因表達GFP而為綠色，腫瘤成分因表達RFP而為紅色，清晰顯示了腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間相互交織在一起的復(fù)雜關(guān)系。

　　再培養(yǎng)細(xì)胞的熒光示蹤效果：移植瘤細(xì)胞經(jīng)過再培養(yǎng)，具有增殖能力的細(xì)胞呈貼壁生長。在熒光相差顯微鏡下，發(fā)出不同熒光的3類細(xì)胞清晰可辨：（1）發(fā)紅色熒光的SU3-RFP子代細(xì)胞，簡稱GFP細(xì)胞；（2）發(fā)綠色熒光的宿主細(xì)胞，為RFP與GFP融合細(xì)胞，簡稱RFP/GFP細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測RFP、GFP和RFP/GFP細(xì)胞的比例分別為（88.99±1.46）%、（5.59±1.00）%和（4.11±1.02）%。

　　GFP細(xì)胞的亞克隆：分選獲得的GFP細(xì)胞培養(yǎng)7~10d后，形成大量獨立的細(xì)胞集落。取單個細(xì)胞培養(yǎng)后，獲得了具有無限增殖能力、穩(wěn)定表達Nestin和CNP蛋白的H1和H9兩個亞株。兩株細(xì)胞的形態(tài)均以棱形為主，兼有多角形和星形，H9細(xì)胞的GFP有關(guān)強度明顯弱于H1細(xì)胞，CNP的蛋白表達反而強，Nestin則在兩株細(xì)胞中均呈陽性表達。

　　H1和H9細(xì)胞的體外生長特征：H1和H9細(xì)胞在體外均可以長期傳代，表現(xiàn)出無限增殖的特征。細(xì)胞生長曲線顯示。細(xì)胞集落形成實驗顯示，H1和H9細(xì)胞的集落形成率分別為44.4%和20.2%，H1細(xì)胞的克隆集落形成能力明顯強于H9細(xì)胞。Transwell侵蝕實驗中，SU3細(xì)胞侵入小室底部生物膜的細(xì)胞數(shù)量明顯多于H1和H9細(xì)胞侵入小室底部生物膜的細(xì)胞數(shù)分別為：259.6±23.3和139.9±30.2，H1細(xì)胞的侵蝕能力明顯強于H9細(xì)胞（P=0.0052），但而二者均低于用于誘導(dǎo)癌變的SU3細(xì)胞，其侵入小室底部生物膜的細(xì)胞為690.4±102.5（H1細(xì)胞與SU3細(xì)胞比較，P=0.0017；H9細(xì)胞與SU3細(xì)胞比較，P=0.0020）.

　　H1和H9細(xì)胞的遺傳性特征：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，以正常淋巴細(xì)胞二倍體為正常對照，H1和H9細(xì)胞的DNA合成能力均很強，為超四倍體。染色體G顯帶表明，H1細(xì)胞染色體主流為80條左右，H9細(xì)胞染色體主流為102條左右，均為端著絲粒，符合鼠源細(xì)胞染色體特征，并均為異倍體。熒光原位雜交技術(shù)（florescence in-situ hybridization，F(xiàn)ISH）性別檢測結(jié)果顯示，用于接種的SU3-RFP細(xì)胞為XY型，源于男性患者，而被誘變成癌細(xì)胞的H1和H9細(xì)胞為XY型，源于雌鼠。

　　H1和H9細(xì)胞的致癌率：H1細(xì)胞皮下接種裸小鼠后，表現(xiàn)出極強的增殖能力，平均20d左右，裸小鼠腫瘤直徑可超過1cm，致瘤率達100%（10/10）。移植瘤組織切片光鏡下可見，腫瘤細(xì)胞密集排列，有大量纖維細(xì)胞交織存在。H9細(xì)胞接種到裸小鼠盧內(nèi)，40d左右裸小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，致癌率達到100%（5/5）。移植癌組織切片光鏡下可見，腫瘤細(xì)胞密集排列，異形明顯，并廣泛侵襲腫瘤周圍的正常腦組織。

　　討論
　　表達GFP的親鼠首先于美國Jackson實驗室培育成功，以原核注射方式導(dǎo)入線性化的加強型GFP（eGFP）載體于受體鼠受精卵，獲得表達GFP的成年鼠，再與C57BL/6J小鼠回交，建立了穩(wěn)定表達GFP的C57BL/6J小鼠。本實驗用的C57BL/6J GFP熒光小鼠從南京大學(xué)購得，NC-C57BL/6J裸小鼠是由蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科實驗室的NC系裸小鼠（♂）與C57BL/6J小鼠（♀）雜交而成，全身穩(wěn)定表達GFP（毛發(fā)和紅細(xì)胞除外）。這種GFP具有如下優(yōu)點：（1）性質(zhì)穩(wěn)定：即使在甲醛固定的標(biāo)本中，熒光仍然保持穩(wěn)定。-70℃冰箱保持6周以上熒光不受影響。（2）無毒性：分子量小。相對分子質(zhì)量為25000~30000，對受體細(xì)胞基本無毒性。（3）便于實時定位觀察：GFP使用方便，可行活細(xì)胞實時定位觀察。

　　有關(guān)有關(guān)蛋白在腫瘤領(lǐng)域的示蹤研究剛剛起步。Yang等將GFP分別轉(zhuǎn)染于胰腺、肺和乳腺等腫瘤細(xì)胞，并原位移植至裸鼠體內(nèi)，獲得了裸鼠全身癌灶的影像。Hoffman將傳染U87-RFP的膠 質(zhì)癌細(xì)胞原位移植于表達GFP的裸小鼠，在體內(nèi)活動觀察了移植瘤的生長狀況。Farin等將標(biāo)本有eGFP和DsRed-2的C6細(xì)胞注入到新生鼠的前腦，連續(xù)觀察了C6在腦中不同時期的遷移和增殖。我們課題組將入腦膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞SU2接種于自行培育的NC-C57BL6/J裸小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞的融合；也觀察到膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞在移植瘤組織重構(gòu)中起著重要的作用，并參與腫瘤血管擬態(tài)的形成。Zhou等采用類似的實驗?zāi)Ｐ停�開展了人腦膠質(zhì)瘤SHG44的移植實驗。在本研究中，我們在自建的SU3-RFP/GFP腦腫瘤模型中，采用雙色熒光示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)只有宿主才有的腦腺GFP細(xì)胞誘導(dǎo)成癌細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)對進一步研究腫瘤微環(huán)境組成成員的相生相克關(guān)系有主要意義。

　　間質(zhì)細(xì)胞及其分泌的因子是組成腫瘤微環(huán)境的主體，其余腫瘤細(xì)胞的關(guān)系，在潛伏（隱匿）期以相克為主，在進展期以相生為主。后者是指間質(zhì)細(xì)胞（如免疫炎癥細(xì)胞中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等機制固有免疫細(xì)胞）不再起監(jiān)視作用，而起促進腫瘤生長的作用。本研究結(jié)果顯示，宿主腦組織中廣泛存在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在移植的腫瘤細(xì)胞重構(gòu)過程中被的誘導(dǎo)癌變了。從微生態(tài)角度考慮，癌變神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞屬于組成腫瘤微環(huán)境的成員之一，有可能在腫瘤惡性進展過程中起著重要的作用，但這種變化在臨床上是難以發(fā)現(xiàn)的，因為癌變的起始細(xì)胞和誘導(dǎo)癌變的細(xì)胞都是膠質(zhì)細(xì)胞。我們用RFP和GFP分別示蹤接種的外源細(xì)胞和原本存在的宿主細(xì)胞，結(jié)果顯示，代表宿主的GFP細(xì)胞癌變了。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特征細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白檢測結(jié)果為Nestin陽性、CNP陽性、GFAP陽性，表明H1和H9細(xì)胞是癌性少突細(xì)胞，這與Liu等的報道的少突前體細(xì)胞易癌變現(xiàn)象相符。

　　鑒于宿主細(xì)胞被接種的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)癌變是新的發(fā)現(xiàn)，對癌變細(xì)胞的鑒定必須充分。本實驗結(jié)果提示如下3個方面的證據(jù)：（1）在培養(yǎng)液中貼壁生長的細(xì)胞能無限制傳代、細(xì)胞間生長接觸抑制消失、高集落形成率、在Transwell膜上的高穿過率、在細(xì)胞增殖曲線上反映的高增殖速度和DNA合成能力上表現(xiàn)為異倍體等癌細(xì)胞表型；（2）移植裸小鼠100%的致癌率和腫瘤組織病理學(xué)符合惡性腫瘤的特征；（3）細(xì)胞表達GFP、染色體端著絲粒和FISH的性別鑒定結(jié)果，都能證明癌變的兩株細(xì)胞為鼠源性，而且由于表達神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，可判定其移植瘤為鼠源性膠質(zhì)細(xì)胞癌。這一新發(fā)現(xiàn)對進一步研究腫瘤微生態(tài)環(huán)境中各成員間的相生相克關(guān)系具有重要的意義。（來源：中華腫瘤雜志2013年1月 第35卷 第1期《膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞可誘導(dǎo)宿主腦膠質(zhì)細(xì)胞癌變》陳延明 費喜峰 王愛東 代興亮 張金石 崔寶乾 張全斌 趙耀東 陳驊 王之敏 蘭青 董軍 黃強）

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